牛胚胎体外生产技术概要

胚胎体外生产也称体外受精技术，是继人工授精、胚胎移植技术之后，家畜繁殖领域的第三次革命。牛胚胎体外生产包括卵子的成熟培养、精子获能、体外受精和胚胎早期培养等4个连续过程。自1982年以来，家畜体外受精技术，尤其是牛体外受精技术的发展十分迅速，仅仅10年时间，就已从理论上、方法上得以充分的完善和发展，成为动物胚胎工程及细胞工程领域内的一个基本和重要的研究分支，并从20世纪80年代末就开始进入应用阶段。这项技术的出现还大大推动了相关学科的发展。本文主要是对牛胚胎体外生产作一概括性的评述。

研究概况

1982年Breaket等在美国率先培育出世界第一头体外受精牛犊，使家畜体外受精技术的研究取得了重大突破。但他们所采取的精子获能方法是用高渗盐溶液处理精子，因此重复性较差。后来的研究者们放弃了这种方法。1984年，日本学者Hanada等首次利用钙离子做载体和咖啡因等化学药物　诱导山羊、绵羊及牛精子获能均得到成功的结果，并利用这种方法于同年培育出世界首胎试管山羊。由于这种获能方法稳定性好、重复性强，很快被各国研究者所采用。一年后，日本的Hanada等(1985、1986)利用这一方法得到了牛体外受精（IVF）胚和羊体外受精（IVF）胚移植成功的结果。在此基础上，又有人提出了类似的肝素—咖啡因诱导获能法。在卵母细胞的成熟培养及体外受精（IVF）卵的体外发育培养方面也不断出现新的方法和更为完善的技术。由于家畜体外受精（IVF）技术，尤其是牛体外受精（IVF）技术在养牛业上有着巨大的应用潜力，世界上许多发达国家均投入大量的人力和财力进行了牛胚胎体外生产方面的开发性研究，从而促使牛体外胚生产从实验研究开始走向商品化应用。目前世界上在这项技术上投入力量最大的有日本、美国等。

牛体外胚生产的主要技术环节

包括牛卵子的体外成熟、精子获能、卵子体外受精、受精卵早期培养等4个连续过程。另外，牛体外胚胎的冷冻保存及胚胎的移植结果是牛胚胎体外生产效率的最终评定指标，本文在这里不再赘述。

1 牛卵子的体外成熟（IVM）

1.1 卵母细胞的采集

卵母细胞的来源有3种：一是从经过超排处理的母牛输卵管内获取成熟的卵细胞，它们不经成熟培养，可直接与获能精子受精，但牛体内成熟的卵母细胞的数量非常有限，现很少被采用；二是通过切割法或抽吸法等机械分离法从屠宰场废弃的母牛卵巢上获取未成熟的卵母细胞，具体方法如下：将收集卵巢置于25～35℃的生理盐水中，添加抗菌素，用装有18号针头的5ml注射器，从卵巢表面直径为2～5ml小卵泡中抽取卵母细胞，一般每只卵巢可收集卵母细胞5～25枚。此方法中卵巢保存温度对体外受精起着重要作用，此方法获取的卵母细胞成本低，但难以做到良种化；三是利用超声波扫描仪和吸卵设备从活体母牛卵巢上吸取2～6ml的卵泡卵母细胞，此方法每周1～2次，可连续作业几周，每次每个供体可获卵母细4～8枚，然后分类、洗涤。在牛体外胚生产中，一般选择后两种方法进行牛卵母细胞体外成熟（IVM）和体外受精（IVF）。

1.2 卵母细胞的体外成熟培养

体外培养使卵母细胞成熟的研究，自1965年以来有了很大的进展，已先后在10余种哺乳动物体上获得成功。最初所使用的培养液为 Tyrode、Gey、arle、Hanks等盐类缓冲液。近年来，已转向应用合成培养液，如目前被应用最为广泛的TCM－199。应用TCM－199对牛的卵母细胞进行体外培养，成熟率平均达到 80％以上。实验证明：培养条件与受精率和囊胚发生率有较强相关性。因此，牛卵母细胞成熟培养液的研制已成为牛胚胎体外生产的重要内容之一。近期在卵子培养液方面主要进行了以下几方面的改进：①在培养液中加入卵泡液，卵泡液作为卵母细胞发育的微环境，在决定卵母细胞未来命运中起主要调节作用。②在培养液中加入细胞成分，如卵丘细胞、颗粒细胞，现普遍采用制备颗粒细胞单层添加到卵母细胞成熟培养液中，以期获得较高的卵母细胞成熟率、受精率及发育率。许多学者研究表明，卵泡内细胞，特别是颗粒细胞、卵丘细胞对牛卵子的细胞核成熟和细胞质成熟是非常重要的。③在培养液中加入对卵子体外成熟有促进作用的激素，如 FSH、HCG、LH等。④在成熟培养液中添加血清，能强烈地改变细胞功能，使颗粒膜和膜细胞对卵母细胞减数分裂恢复的抑制失去效果，同时也能为卵母细胞成熟提供所需的蛋白质，从而促进卵丘细胞层扩散和卵母细胞发育成熟。绝大多数情况下，是在培养液中添加犊牛血清(FCS)与LH、FSH和雌二醇[E2]结合使用。培养液中加入发情牛血清（ECS）比FCS和其他激素更能提高成熟卵母细胞的受精力和卵裂率，添加浓度 10％为宜。目前，牛、羊卵母细胞成熟培养大多在 TCM－199＋10％ECS，在有 GnRH或LH存在下，38.5℃、5％CO2。、100％湿度条件下，经24～26h培养，成熟率一般为80％～90%。然而，由于添加的激素或血清使体外受精率变化很大。因此，目前研究出了不添加血清的（特定）牛卵母细胞体外成熟（IVM）体系。

2 精子体外获能

2.1 精子体外获能的过程

一般认为，雄性动物产生的精子，必须在雌性生殖道内停留一定的时间，发生一定的生理变化后，才能具备受精能力，此过程称为精子获能。精子的获能过程是多时相、多步骤的复杂变化过程，一般认为获能的第一阶段是脱出精子表面的抗原物质和去能因子，增强细胞膜通透性，此过程在一定程度上是可逆的生理学变化。第二阶段是精子细胞膜蛋白变化，即发生顶体反应，此过程是不可逆的结构上的获能。精子获能方法有2种，即体内获能和体外获能。体内获能是从交配母畜的子宫内冲取精子用于受精。体外获能一般分为两步，一是精子的洗涤，经1次或多次离心后除去杂质、精清、死精子、低活力的精子、冻精保护液及稀释液等，目前牛精子洗涤液一般采用碳酸缓冲TALP-TVF液；二是精子的获能处理，主要是使用高离子强度液（His）、钙离子载体、肝素等，以促使钙离子进入精子顶体并刺激精子内部PH升高，从而诱发精子获能。

2.2 精子获能的判定

目前主要采用观察精子运动形式的变化来确定精子是否获能。精子开始获能时，运动非常活跃，尾部振幅大而有力，获能后精子由直线前进变为激烈的曲线运动（鞭打状），即超活化。其特征为头部侧向曲线运动，鞭打幅度加宽和沿星状自旅轨道运动。尾部运动形式在不同动物间有一定差异。但由于研究手段的限制，难以将其量化。

3 卵子的体外受精（IVF）

成功的体外受精不仅依赖卵母细胞的成熟和精子的获能，而且精卵相遇时间、精液品质、精子密度、精卵比例也是重要的影响因素。目前体外受精具体做法是：精子在受精处理基础液碳酸缓冲液（TALP）中，洗涤2～4次（去掉精清）后，用含有肝素的TALP上浮，分离出活力强的精子，将获能好的精子以一定浓度在受精液中与卵母细胞共孵育。精卵共孵育时间与受精体系有关，一般在TALP液中需要18～24h，时间太短受精率下降，时间太长则多精子受精数增多。近几年来，人们为了取得更好的受精效果，在受精液中加入促进精子运动的物质，如咖啡因、次黄嘌呤、肾上腺素等。此外研究证明：通过激光照射精液或延长卵母细胞体外培养时间均不同程度地提高体外受精率。长期以来卵子多精子受精问题一直是困扰体外受精的一个难点，究其原因可能是体外受精卵分泌的皮质颗粒细胞不能很好地扩散。

4 受精卵的体外培养（IVC）

受精卵需在培养液（或输卵管）中发育到桑葚胚或囊胚后移植给受体，才能获得较高的妊娠率。目　前，牛早期受精卵体外培养的主要障碍是发育阻滞。牛受精卵体外发育阻滞出现的时期为8～16细胞。这种体外发育障碍的存在，使通过牛体外受精技术得到的试管后代成功率很低。因此，如何克服牛胚胎体外发育受阻现象，将体外受精卵培养成具有活力和可操作的桑葚胚或囊胚，一直成为牛胚胎体外培养研究的热点。目前，为了克服阻滞现象，有助于产生高质量的桑葚胚或囊胚，主要采取以下方法：①利用临时中间受体，即把牛体外受精卵放入结扎的中间受体兔或绵羊的输卵管中，培养至桑葚胚或囊胚，再移植到受体或冷冻保存。此方法优点是胚胎质量高，能耐受冷冻保存。但操作过程复杂，胚胎丢失严重，不适合胚胎的大批量生产。经研究发现，同源或异源输卵管细胞共同培养都能显著提高牛早期胚胎的卵裂和发育。②利用体细胞在体外与受精卵共同培养，促进胚胎发育，获得了较高的囊胚发育率。目前，用于共培养的体细胞主要有输卵管上皮细胞（BOEC）、颗粒／卵丘细胞（GCs）、子宫内膜细胞、成纤维细胞和大鼠肝细胞等。关于共同培养体系对胚胎发育的确切机制尚不清楚，其作用可能是：体细胞产生促分裂因子；体细胞分泌物促进胚胎细胞的分化；体细胞可代谢或去除培养液中的胚胎毒性因子；3种可能性同时存在。

前景展望

近年来，牛体外胚胎生产工艺研究已取得了巨大的成绩，有理由相信，随着生物技术的发展和对牛卵母细胞成熟、控制机理、胚胎早期培养所需营养促生长因子等方面的深入研究与探讨，牛体外胚生产将会得到进一步完善，从而为现代生物工程技术和畜牧业生产提供更多的胚胎来源与相关技术。可以预料，随着科学技术的进一步完善，大量生产牛体外胚胎将会具有很大的潜力。