哺乳动物性别控制的原理与方法

在畜牧生产中许多性状受到性别因素的制约，如：只有母奶牛才能产奶；要实现一个优良品种的迅速扩繁，必须有足够数量的基础母畜；而公犊的生长速度快，体型大，屠宰率高，所以在肉用品种生产中更希望有更多的公犊。就生产成本来讲，非育种用公犊是奶牛生产的副产品，如能实现性别控制，即使动物生产与人类意愿相一致性别的后代。则可以避免非育种用公犊的出生，在妊娠母牛和犊牛的管理上可节约近一半的费用，这在奶牛生产中是一笔可观的费用。由此可见，性别控制技术对于我国现有生产条件不变而奶制品和肉制品需求迅速增加的现状来说，更意味着生产资料的高效利用和畜牧业生产效率的提高。同时，性别控制方法可以使我们通过后代性别的选择而避免性连锁疾病的发生。因此性别控制技术具有非常重要的理论和现实意义。

性别决定的机理

性别形成的机理是进行性别控制的基础，学者们对此方面的大量探索为进行性别控制提供了理论指导。上个世纪随着孟德尔遗传理论的重新确立，人们提出性别由性染色体决定的理论。1923年，Painter证实了人类X和Y染色体的存在，指出当卵子与X精子受精，后代为雌性，与Y精子受精，后代为雄性。哺乳动物胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，但已具备了有分化潜能的生殖器官的原始胚基（张忠诚等，2003）。如果性染色体为XX，那么性腺原基发育为卵巢，个体为雌性；如果性染色体为XY，那么性腺原基发育为睾丸，个体为雄性。家畜性别的分化则是在性染色体基因和常染色体性别相关基因的复杂作用下的最终结果。Jacobs 等在1966 年发现雄性决定因子位于Y染色体短臂上，后来的研究表明，Y染色体的性别决定区( sex determining region of the Y,SRY)即为性别决定因子。性别发育以Sry基因为核心（文国艺，2004），Sry基因在胚胎发育的早期开始表达，不同物种Sry基因表达的时间也有区别，小鼠在10.5天时开始表达，而猪在21~26天时开始表达（张忠诚等，2003），Sry基因表达使性腺原基发育为睾丸，睾丸形成后，其间质细胞分泌睾酮产生雄性结构，支持细胞分泌抗缪勒氏管因子，抑制缪勒氏管发育。而对于雌性胚胎（或Y染色体缺失，或Sry基因缺失、突变），性腺原基发育为卵巢，由卵巢产生的雌激素能使缪勒氏管发育为雌性结构。但在胚胎早期，多种基因及产物如孤核受体Wt1、Sox9等常染色体基因蛋白等在诱导性腺的这个农场分化中也起到一定的作用。

性别控制途径及方法

理解了性别控制的生理机制，就可以根据其生理机制进行下一步的性别控制工作了。根据实施的时间、结果及操作的对象不同，家畜性别控制的方法可以分为很多种，但这些方法最终归结为两个水平三种方法。根据实施的时间可以分为两个水平：即在受精之前进行，和受精后的早期胚胎形成阶段进行。而根据实施方法可分为以下三种。

哺乳动物个体因性染色体的不同而表现为不同的性别，性染色体为XX的就为雌性个体，而性染色体为XY的个体就为雄性，这样在形成配子时，雌性个体只形成一种卵子，而雄性却形成两种精子，一种精子含有X染色体，命名为X精子，另一种精子含有Y染色体，命名为Y精子。受精过程中配子的结合类型决定了后代个体一生的性别，如果X精子与卵子结合形成雌性个体，而Y精子与卵子结合则形成雄性个体。只要采取措施将这两类精子分离开，并根据需要采用特定类型的精子进行人工输精，就会获得需要的性别，实现性别控制，这就是现在特别流行的受精前进行性别控制的一种重要形式：X、Y精子分离技术；在授精同时，采取一定的技术手段对母畜生殖道的生理环境进行干预，使其只利于一类精子的受精活动，从一定程度上也能实现对后代个体性别的控制，这就构成了受精前性别控制的另一种方式：母畜生殖道环境干预技术。而在胚胎发育的早期对胚胎性别进行鉴定，并根据鉴定结果决定胚胎的去留，实现性别控制，就构成了受精后性别控制的技术手段。

1 X、Y精子分离技术

X、Y精子的差别是X、Y精子分离的基础。同卵子相比，哺乳动物精子细胞小得多，头部长度仅为5~10um左右，牛精子的中段和主段60~70um左右（高建明，2003）。就是在这样小的精子细胞上，科学家们找到了很多X、Y精子的细微差别：在两种精子中，X染色体的DNA含量多，这种差异因物种而不同，一般多在3~5%之间，人为2.9%，猪为3.6%，牛的为3.8%（Johnson, 1992；Johnson等,1989；Sumner等，1976）；X、Y精子的比重分别为1.1141g/cm3和1.1134 g/cm3（陈元明，1994）；采用芥子奎丫因（Quinacrine mustard，Q-M法）染料对Y染色体染色（Barlow等，1970），Y染色体长臂末端特异性的被深染，并形成强荧光小体（F小体）；Y精子能表达H-Y抗原，这种抗原主要存在于Y精子的顶体部分（朱晓华等，2001）。学者们根据两种精子间的这些差异研究了很多精子分离方法。

1.1 物理分离法 以前，人们根据X 精子与Y精子物理特性上的差异分别采用了沉降法、密度梯度离心法、凝胶过滤法和电泳法等各种技术分离精子并进行临床实验，但许多研究结果表明以上几种方法分离的精子数少、准确率低且可重复性差（李永福，2003）, 所以现在很少应用。目前比较理想的方法是根据X 精子DNA 含量比Y 精子高（一般多在3~5%之间），采用荧光染料染色时会产生较强的荧光，而进行的流式细胞分离法。利用此方法已成功地分离了小鼠、兔、牛、羊和猪等动物的X 精子与Y 精子, 并在不同动物种间取得了较为理想的分离效果（张成等，2005）。这是目前分离效果最准确的一种方法，同时本技术也在不断的改进中，目前分离速度已能达到每秒各分离X、Y 精子2 500 个（文国艺，2004）, 准确率超过95%。我国内蒙，新疆，黑龙江，广西等省市自治区都纷纷引进该分离仪器进行能够精子分离试验，并且加拿大的性控精液也已经引入国内市场，但由于每剂冻精的精子数量比正常精子数量低一个数量级，且受其专利限制，分离费用昂贵，很难在生产实践中广泛应用。

1.2 免疫法 该方法是利用精子膜上存在的性别特异抗原制备特异抗体，然后利用特异的抗原抗体反应将两种精子分离的方法。早在1955年，Eichwald 等在小鼠皮肤移植试验中发现了雄性特异性抗原H-Y的存在。罗承浩等用H-Y抗血清制作性别化冷冻精液结合体外授精得到雌性后代比率为60.7％，比自然出生母犊性比率提高10.7％。Zavos 等(1982)用兔子生产抗血清进行实验, 把H-Y抗血清注入母兔阴道15min 后输精, 产出的雌性兔为74.2%；1987 年他又采用免疫过滤法对兔子和牛进行试验, 结果后代中雌兔为78.9%、母犊为74.4%。但由于H-Y 抗原是一种弱抗原，所以其准确性比较低，有时重复性也很差。但同目前的其他方法比，这种方法是最为方便的，而且一旦找到理想的可利用的性别特异抗原，有可能大大提高分离效率并且降低分离成本。为此国内外许多学者进行了不懈的努力，现在中国农科院畜牧研究所正在积极地进行精子的性别特异蛋白分离研究，研究表明，两类精子间的蛋白差异是存在的，并且现在蛋白的分离方法也越来越成熟，虽然到目前为止还没一个理想的结果（王栋，2005），但相信在不远的将来，经过科研工作者的努力一定能够分离到精子的性别特异膜蛋白，利用抗原抗体反应实现精子的分离，最终实现遗传疾病和性别的有效控制。

2 母畜生殖道环境的干预技术

除了进行精子分离，在授精时还可以对生殖环境进行干预，以实现受精前的性别控制。这是人类最早采用的性别控制方式。《褚氏避书》这样论述，“男女之合，若阴血先至，阳精后冲，而男形成矣，阳精先至，阴血后参，而女形成矣”。归结为，精子先于卵子到达生殖道，生女，而卵子先于精子到达生殖道，则生男。后来这种理论也被应用于家畜的性别控制。家畜发情是一种生理过程，在这个过程中，输卵管分泌物的PH值发生了逐渐由酸性变成碱性的变化，而X、Y精子也有不同的酸碱耐受性，X精子能耐受酸性环境，而Y精子能耐受碱性环境。来自精液电泳的实验表明（杜荣骞等，1992），X、Y精子表面电荷有差别，在电场中，表现出不同的泳动速度和泳动方向，这也是X、Y精子对酸碱耐受性不同的一个旁证。所以学者们通过在发情期不同的时间人工输精进行性别控制。以排卵为界，排卵前输精多生母，排卵后输精多生公（齐义信等，1995；陈元明等，1994）。学者们还尝试在生殖道中或精液中添加一些物质以达到改变授精环境的目的。这些物质有酸性缓冲液（王公佐）、醋酸（黄美玉）、乳酸（冯玉麟）、精氨酸（黑木常青，1978；陈元明，1994）等，王光辉等（2000）用5%L型精氨酸注入母牛子宫内，使生殖道的PH值降低，提高了产母犊率（63.8%）。这些研究都取得了一定的进展，但效果不是很理想。

3 PCR早期胚胎性别鉴别

如果没有成功地分离两类精子，我们也可以在受精后的第6~9天内对形成的胚胎进行性别鉴别。这是因为在Y染色体上，存在有与雄性性别有关的特异基因，如Y染色体性别决定区基因（Sex determining region of Y，SRY）、睾丸决定因子（testis-determining factor, TDF）以及Y染色体特异重复序列等的Y染色体上的标志性序列。这些基因序列都是雄性所特有的，根据这些特异序列设计引物，对早期胚胎样品进行PCR检测就可实现早期胚胎的性别鉴别，最终实现性别控制。现已建立起一些PCR方法体系，如：巢式PCR技术（Appa Rao，1999；陈从英等，2003），两步PCR法（J H Park，2001），单重PCR法（J F Hasler等，2002）。日本学者推出了LAMP法鉴别牛早期胚胎性别，缩短了检测时间，但该方法在检测体系中引入了化学显色反应体系，对检测过程的反应条件特别敏感，稍有污染就可能会影响到检测结果的准确性，同时高昂的检测费用和专门的检测仪器，使其在实践应用中受到了限制。中国农科院畜牧研究所胚胎工程与繁殖技术研究室的科研工作者也在这方面做了探索研究（王宗礼，2004），并且近来又在研究中取得了新的突破，不但把检测的时间降到了1个小时，并且大大地减低了检测成本，使该方法更简便、实用。

目前性别控制研究的可能途径及出路

比较上述性别控制方式发现，在胚胎期进行的鉴定即使非常准确，也将有一半非理想性别的胚胎被丢弃，相应于形成这部分胚胎的人力、物力也将被浪费掉了。从这种意义来说，PCR早期胚胎性别鉴别是一下策，但在目前还没有一种精子分离方法能获得满足生产中常规使用的精子数，因此早期胚胎性别鉴别技术仍是性别控制的有效途径（Howes EA,1997；李树静等，2003）；受精前的X、Y精子分离技术是性别控制的最根本途径，目前流式细胞分离技术虽然成本昂贵，但这一技术也许为新的精子分离技术研究提供了研究材料，新的蛋白分离技术的产生和多项技术的集成应用，以及基因工程手段及免疫学方法的研究，为性别特异蛋白的分离，特异膜抗原结构的分析、抗原免疫原性的改造，进而利用免疫法实现性别控制提供了新的机遇。