详解病毒样颗粒疫苗在猪病防控中的应用研究！

病毒样颗粒（virus-like particles， VLPs）是由病毒的一个或多个结构蛋白自动组装而成的空心颗粒，没有病毒的核酸（DNA/RNA），不能自主复制， 在形态上与天然病毒粒子相同或相似， 俗称伪病毒、假病毒。VLPs 不具有感染性，但具有很强的免疫原性，它可作为免疫原，通过和病毒感染机体一样的途径呈递给免疫细胞（T、B 淋巴细胞），进而有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。VLPs 因其免疫原性好、安全性好，是研制安全高效的预防病毒病的潜在候选疫苗。迄今为止，国内外针对人和动物的病毒性疾病，在市场上使用和临床研发中的VLPs 疫苗至少35种以上。目前，市场上还未有针对畜牧业常见疾病的VLPs 疫苗，但是已经开始了相关课题的研究。

1VLPs 在猪病防控中的应用研究

1.1 猪细小病毒病

猪细小病毒（PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，PPV 感染主要引起胚胎和胎儿死亡、重吸收、流产、木乃伊胎等，但母猪不表现明显的症状。VP2 是构成PPV 病毒粒子的主要衣壳蛋白，也是中和抗体作用的主要靶蛋白，具有良好的免疫原性，在哺乳动物细胞内或杆状病毒表达系统进行VP2的体外表达，可以在体外自我装配形成VLPs。另外，VP2 蛋白可以作为一种抗原的转运载体，携带外源表位，组装成嵌合表位VLPs，嵌合表位VLPs 免疫动物具有双重的免疫效果。Martine 等（1992） 将PPV VP2 基因克隆到杆状病毒系统中，并成功地在昆虫细胞中高效表达，表明VP2 多肽能够自我装配成VLPs，该研究为PPV 新型亚单位疫苗的研究提供了新思路，而且PPV VLPs 不仅自身可以作为疫苗，在外源多肽的转运及多价疫苗的研制中也发挥重要作用。F.G.A. Adriaan 等 （2006）用昆虫细胞中表达的PPV VP2 基因产物制备VLPs 疫苗，在添加免疫佐剂的情况下，VLPs 疫苗可在猪体内产生高滴度的血清抗体。

1.2 口蹄疫

董艳美等（2013） 选择了口蹄疫病毒（FMDV）O/HLJOC12/03 毒株的VP1 蛋白上关键的抗原决定簇第141 ～ 160 位氨基酸对应的核苷酸序列， 利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）插入到MS2 噬菌体的外壳蛋白基因的特定位点，经过大肠杆菌诱导表达FMDV 的抗原决定簇多肽表达展示在MS2 表面的VLPs。结果证实该VLPs 蛋白可以很好地诱导被免疫的小鼠产生特异的抗体，且具有很好的免疫原性。该研究为进一步开发出新型的FMD 的VLPs 疫苗提供了实验依据。董虎等（2014） 将FLAG 序列通过融合PCR 技术插入FMDV 结构蛋白VP1GH-loop 可变区，并通过大肠杆菌原核表达技术表达FMDV 衣壳蛋白VP0、VP3 和嵌合型VP1，在体外组装出嵌合FLAG 外源多肽的VLPs，以期为研究制备多联或多价FMDV 的VLPs 疫苗奠定基础。潘群兴等（2010）为增强表位疫苗的免疫原性，为了研制开发免疫原性更好、成本低的新型疫苗，以PPV VP2 病毒样颗粒作为外源免疫原性多肽的分子载体，利用杆状病毒表达载体系统表达了O型FMDV VP1 中T 细胞表位肽嵌合的PPV VP2 病毒样颗粒[rPPV ：VLP（FMDV）]。潘群兴等（2013）进一步研究表明，该嵌合FMDVT 抗原表位PPV VP2 表达蛋白构成的细小病毒样颗粒，在无免疫佐剂存在的情况下免疫小鼠后，在低浓度FMDV 抗原下能够产生特异性T 淋巴细胞增殖反应，表明嵌合VLPs 具有良好的免疫原性，这为在猪体进行该VLPs 的免疫研究以及不需要佐剂的颗粒化疫苗的研制提供了实验依据，也为PPV、FMDV 二联因工程疫苗的研究奠定了基础。

1.3 猪伪狂犬病

国内外诸多学者已应用杆状病毒表达系统成功表达出PPV 的VP2 蛋白及其自我装配成的VLPs，但应用伪狂犬病病毒（PRV）表达系统表达PPV 的VP2 蛋白及其自我装配成的VLPs 还鲜见报道。陈杨等（2011）成功实现了利用PRV 载体表达PPV 的VP2 蛋白的VLPs， 通过IFA 检测了VP2 基因在PRV 中的表达， 并通过电镜观察到了VP2 基因表达产物可自我装配成VLPs， 且在1 个细胞中可以同时观察到PRV 与PPV 两种VLPs，实现了利用PRV 表达系统表达PPV 的VP2 蛋白的VLPs。若进一步研究表明PRVSA215/VP2 株可作为疫苗株，则通过培养PRV SA215/VP2 就可以直接生产出PRV-PPV 二联疫苗，不需要灭活或分离PRV，并起到“一免多防” 的功效，在生产成本方面也将极具优势。

1.4 猪瘟

猪瘟病毒（CSFV）是引起猪瘟的病原，相应于其非结构蛋白NS2-3 的1446 ～ 1460 氨基酸残基的多肽E290，含有CSFV 特异的辅助性T 细胞表位和CTL 细胞表位，在体液免疫和细胞免疫中均具有重要作用，为CSFV 的免疫优势T 细胞抗原表位。范京惠等（2007）将PPV 的VP2 基因克隆至真核表达载体pMelBacA 的Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ之间的多克隆位点，并在VP2 基因的5' 端插入CSFV 的T 细胞表位基因E290，在成功构建了重组子pM-VP2-E290 阳性质粒的基础上，将其与Bac-N-Blue DNA 共转染昆虫细胞sf9，形成的重组杆状病毒在体外表达后，表达蛋白具有天然蛋白的生物学特性，且通过自我组装后形成的VLPs， 在无免疫佐剂的情况下免疫小鼠，诱导机体产生了高效价的抗PPV 抗体及CSFV 特异的CTL 反应，而且产生的抗PPV 抗体效价显著高于灭活疫苗免疫组。这为在猪体进行此VLPs 的免疫研究以及不需要佐剂的颗粒化疫苗的研制提供了基础资料。徐义刚等（2007） 用乳酸菌表达CSFV 特异性的CTL 表位E 290和PPV 的VP2，口腔免疫猪， 结果表明在没有佐剂的条件下，重组的乳酸菌可以诱导强烈的黏膜免疫及CSFV 特异性的CD8+ 型的CTL 反应，可以抵抗致死剂量的CSFV 的攻击。

1.5 猪乙型脑炎

猪乙型脑炎是日本脑炎病毒（JEV） 引起的人畜共患传染病。JEV E 蛋白结构域III（EDIII）是诱导中和抗体的重要区域，EDIII 的一个环肽（loop3） 能通过干扰病毒吸附细胞抑制病毒感染。乙肝核心蛋白（HBC）是乙肝病毒的重要结构蛋白，它在细菌、真核细胞以及哺乳动物细胞内均能被高效表达并自动装配成VLPs，是一种良好的表位展示免疫载体。而且在HBC 特定位置插入的外源短肽序列不会影响HBC 的构象及自我组装，同时插入的外源短肽能以多次重复的方式被展现在VLPs 表面，从而能大大提高表位肽的免疫原性。李朋（2013）首先构建了以HBC 为载体的重组融合表达质粒pET28a-HBC-loop3， 在HBC 的MIR 区插入JEV EDIII loop3 表位基因。结果证明了该VLPs 抗原具有良好的免疫原性。PPV 和JEV 均是引起母猪繁殖障碍的主要病原。为了有效预防这2 种病原引起的疫病，蒋春英（2013） 把JEV E 蛋白上4 个B 细胞表位及2 个T 细胞表位基因与PPV 结构蛋白基因VP2串联起来，构建成VLPs [PPV ： VLP（JEV）]，并在细菌中高效表达。重组蛋白纯化后，体外组装成VLPs 后免疫小鼠研究其免疫原性。结果表明展示JEV 多B 细胞表位和T 细胞表位的PPVVLPs 能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，从而为研究安全有效的JEV 和PPV 二联基因工程疫苗提供了新的思路和方法。在目前应用的一些弱毒疫苗和灭活疫苗存在缺陷和不足的情况下，该嵌合VLPs 具有较大的潜在价值。

1.6 猪圆环病毒病

猪圆环病毒2 型（PCV2）是引起仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）为代表的系列疾病的病原，主要侵害6 ～ 12 周龄的仔猪。PCV2 的感染呈世界性分布，已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。尹双辉（2011）首次利用E.coli表达的重组蛋白在体外制备Cap 蛋白VLPs， 为研制PCV2 VLPs 疫苗奠定了基础。结果证明体外制备的PCV2 Cap VLPs 疫苗有确实的刺激机体体液免疫和细胞免疫反应的能力。李玲等（2011） 应用Bac-to-Bac 杆状病毒/ 昆虫细胞表达系统，获得PCV2b 的重组杆状病毒。将该重组杆状病毒感染HighFiveTM 细胞后， VLPs 在培养上清中的大量存在，为目的蛋白的分离和纯化提供了便利，也为PCV2 基因工程疫苗的产业化奠定了基础。PPV 不仅可引发严重的繁殖障碍性疾病，导致胚胎和胎儿死亡；而且能同PCV2 混合感染，在PMWS 感染中发挥着重要作用。Pan 等（2008）运用PPV VP2 VLPs 作为表位展示载体，在VP2 的N 端插入PCV2 主要T 细胞抗原表位，转染HEK-293 细胞， 在腺病毒表达载体中成功表达出嵌合VLPs［PPV ：VLP（PCV2）］；将该带有PCV2 抗原表位的PPV 颗粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫小鼠，嵌合的VLPs 不仅能诱导小鼠机体产生PCV2 特异性的CTL 反应，还能刺激小鼠产生高效价的PPV 特异性抗体。朱玲等（2010）选择PPV VP2蛋白的2 个位点插入PCV2 ORF2 蛋白，构建2 个不同的重组体，结果获得期望中的具有良好免疫原性的[PPV VP2 ：PCV2 ORF2] 重组VLPs，同时也揭示PPV VPLs 的N 端1/3 适于外源蛋白插入构建重组VLPs。

1.7 猪蓝耳病

李杨（2012）利用杆状病毒表达系统高效表达了PRRSV GP2b、GP5、M 和N 蛋白，并证实共表达GP5 和M 蛋白可组装成VLPs，而GP2b 有助于VLPs 的释放。

1.8 猪传染性胃肠炎

猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床症状的高度传染性疾病，尤其对2 周龄以内的仔猪具有很高的致死率，死亡率可达100%。该病呈世界性分布，给各国养猪业均造成了严重的经济损失。Baudoux 等（1998）研究表明，体外共表达TGEV 的M、sM 蛋白可形成VLPs，且病毒粒子被释放到细胞培养液中。M 蛋白与sM 蛋白形成的VLPs 能够诱导IFN-α的产生，具有防御TGEV 的感染的作用。冷勇等（2013）、宋振辉等（2014）研究利用家蚕Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统表达了TGEV 的M 蛋白、sM 蛋白和N 蛋白的重组杆状病毒，VLPs 的体外组装试验表明在sf9 细胞内M 蛋白单独表达，M 蛋白和sM 蛋白共表达， M 蛋白和N 蛋白共表达， 都可形成VLPs，且VLPs 大小不等。这为进一步研究TGEV 的装配提供理论依据和基础实验材料。

2 存在的问题与展望

VLPs疫苗作为一种新型的基因工程疫苗，其具有强大的免疫优势：表面结构规则，大小合适，不含核酸，不能自主复制，不具有传染性，易于被免疫系统识别并产生很好的免疫效果；在血清中的半衰期较长；质量稳定、安全可靠等等。这极大地吸引了众多疫苗研发者的目光。VLPs 作为免疫原与病毒颗粒一样，在没有佐剂的情况下，低剂量也能激起高效的免疫反应，这将有利于打破肿瘤和病毒慢性感染所产生的免疫耐受，使VLPs 展示表位疫苗具备直接用于治疗的特性。因此，VLPs 作为一种新型疫苗，不仅克服了传统疫苗的不足，而且也弥补了基因疫苗的缺憾，是目前最有发展前景的预防兼治疗的候选疫苗，在肿瘤、传染病、过敏性疾病的预防和治疗上展现了广阔的前景，为科学研究开辟了新的探索领域。然而VLPs 作为预防性疫苗还有很多问题需要探索。如表达系统的选择、VLPs 组装效率的提高以及病毒变异带来的免疫逃避；建立多基因共表达载体的难度大，各个基因表达量的比例难以控制； VLPs 作为疫苗多是几种型特异性多价疫苗，而多价苗之间的量效关系确定较为复杂；有的VLPs必需在添加佐剂后才能达到免疫效果，而佐剂和VLPs 的剂量比例关系需要进一步验证；VLPs 作为疫苗的最佳免疫途径、剂量和保护作用的确切评价还无定论；VLPs 疫苗的免疫效果与全病毒疫苗（灭活苗或弱毒苗）接近，但在交叉免疫方面仍然存在缺陷等等。虽然VLPs 疫苗存在诸多不足，但是基于VLPs 构建多价或嵌合疫苗具有广阔的前景，相信随着以上问题的逐步解决，更多VLPs 疫苗的成功问世指日可待。