水牛冻精颗粒精液的制作与应用

水牛的精液采取冷冻颗粒长期保存，是一种先进技术，它能够充分发挥优良种畜的性能优势，使其不受寿命、地点的限制，一头优良公牛一年可供5000头母牛配种用精，比本交提高上百倍。

1 水牛冷冻颗粒精液理论根据

精子是具有生命活力的性细胞，结构比较复杂，精子在－0.6℃以下至－30℃时，细胞间隙的水分结成冰晶，使细胞脱水，原生质变干，造成精子死亡。另外，大的冰结晶对精子造成机械损伤，使原生质的表层破坏失去保护作用，冰晶渗入精子内部，破坏精子的结构，使精子不能复苏。但是，水的结晶只能在一定温度范围内才能形成，如果低于该温度范围就形成玻璃化体，按照玻璃化学说，原生质发生玻璃化对细胞影响较小，如果快速升温，玻璃化可越过结晶态而直接变为液态，不致于损害精子细胞的结构而使精子死亡。

根据上述原理，在水牛的颗粒精液冷冻的制作过程中，快速越过冰晶危险区的温度（－60℃至－40℃），才能使冷冻精液取得好的效果。

2 水牛冷冻颗粒精液的制作

2.1 采精方法 用假阴道采精法，将黄牛用的假阴道截短，由50cm截至35cm，内胎由67cm截至46cm，改集精杯为胶漏斗接上10～15ml茶色刻度离心管。优点：A、操作方便，减少精子和假阴道的接触，使精子少受外界不利因素的影响;B、收集精液快;C、可直接看出射精量。

2.2 采精频率 采精频繁，每次的射精量和浓度降低;采精次数过少，采得的精液衰老精子多，不能利用，以每月采精10～13次比较合理。

2.3 精液的品质检查 检查要迅速，要求精液浓度在每毫升含精子10亿以上，活力在0.7级以上，精子畸形率不得超出15%。

2.4 稀释 稀释液要有营养，抗菌、抗冷和适当的pH值（6.4～6.8），相等的渗透压。1号液：12%蔗糖77ml，甘油3ml，蛋黄20ml，青霉素10万单位，链霉素10万单位;2号液：14%乳糖75ml，甘油5ml，蛋黄20ml，青霉素10万单位，链霉素10万单位。稀释倍数按照稀释后每毫升含有精子3～4亿为原则。

2.5 平衡 精液衡释后，进行镜检，如和衡释前相比无变化，可将盛精液瓶用棉塞封口，再用4～8层纱布包好，放在装有冰块的广口保温瓶中平衡3～4小时，使精子有一段适应低温的时间，并使保护剂甘油渗入精细胞内，产生抗冻作用。

2.6 颗粒制作

2.6.1 滴冻前镜检：经过平衡的精液，在滴冻前要进行一次镜检，如精子活力和平衡前差异大而又达不到0.6级以上不进行滴冻。

2.6.2 制粒方法：将盛有7成满液氮的广口保温瓶放好，在液氮面上放一铝盒，将铝盒盖翻盖在铝盒上，再接上量温感应器，直测盒盖的温度，当温度达到－90℃至－130℃，方可滴冻。将经过平衡和镜检达到滴冻标准的存放精液广口保温瓶放在方便操作处，不要取出精液瓶，防止升温，用预冷好的滴管吸取精液，每滴0.1ml，快速滴冻，然后进行1～2分钟熏蒸、脱粒、浸入液氮。再进行解冻镜检，如活力在0.3级以上，收入液氮中保存。继续进行滴冻，要求滴冻速度快，手压滴管的胶球用力要均匀，逐步向内压，不得放松。否则，进入空气，出现气泡。

2.6.3 收粒保存：冻完后收入液氮罐小提筒中可做长期保存，在收存中要注意颗粒暴露在空气中时间不能长。经过试验，用塑料瓶存放颗粒比提筒好，可从小瓶上方钻孔进入液氮，取用方便，又可保持颗粒不暴露在空气中。

2.7 解冻

2.7.1 1号解冻液：柠檬酸钠2.9g，蒸馏水100ml;2号解冻液：柠檬酸钠1.7g，蔗糖1.15g，碳酸氢钠0.09g，氨苯磺胺0.3g，磷酸二氢钾0.325g，蒸馏水100ml，青霉素10万单位，链霉素10万单位。以上两种解冻液，2号解冻液解冻后保存时间较长，可以运到站点输精，1号解冻液可用于随时解冻随时使用。

2.7.2 解冻温度：取1毫升解冻液，注入经过消毒的青霉素小瓶内，放在45℃水中预热，当瓶内温度达到40℃～45℃时，放入一粒冷冻颗粒，不断摇动使之融化。镜检精子活力，如达到0.3级以上便可输精。

2.8 颗粒冷冻精液的运输 冷冻颗粒用10立升的液氮缺罐运输，在提取时要填好标签，注明品种、牛耳号、冷冻时间等，运输过程中不能振动、碰击，要存放牢固、通风、防烈日照晒。

3 水牛冷冻精液的应用

3.1 适时输精 信阳水牛一年四季都发情，但有明显的淡旺季之分，一般3～8月份发情较多，其他月份较少。配种年龄一般控制在2.5岁。发情周期平均为25天。每次发情持续时间为1.5～3天。一般在发情45小时后开始输精，此时母牛性欲已消失，子宫颈充血肿胀已减退，子宫颈口待关闭，黏液量减少，实践证明在此时输精受胎率高。

3.2 输精方法 我场多采取直肠把握子宫颈输精法，此法简便、易于操作，精液可直接输到子宫深部，使精液不易倒流，通过直肠触摸不会因误配引起流产，用此种方法输精受胎率高。