口蹄疫疫苗抗原含量检测方法

口蹄疫（Foot-and-Mouth disease virus，FMDV）是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病，对畜牧业有着巨大的危害。目前大多数国家采取计划免疫为主的措施预防和控制口蹄疫，口蹄疫疫苗的质量是保证控制措施实施的重点，而抗原含量直接决定口蹄疫疫苗的质量和免疫效力。

口蹄疫疫苗的生产需要按照GMP要求对工艺流程实行全程监控，包括病毒液收获、病毒液过滤、灭活、浓缩之后活病毒或灭活病毒含量的监测，对于口蹄疫抗原含量的检测分为生产过程中的检测及成品疫苗中抗原量的监督控制。鉴于我国目前的特殊情况，急需建立一种检测口蹄疫病毒灭活疫苗中病毒抗原含量的实验室检测方法,配合其它方法以提高口蹄疫疫苗质量监管力度,确保我国重大动物疫病强制性免疫防控措施的贯彻执行。

1.ELISA方法

用纯化好的FMDV灭活抗原对Balb/c系小鼠进行三次免疫，首免采用颈背部皮下多点注射，使用弗氏完全佐剂乳化抗原；两周后采用腹腔注射进行第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原；两周后采用尾静脉注射再进行加强免疫；3天后进行融合。采用经典的融合方法进行杂交瘤细胞的融合与筛选操作，使用间接夹心ELISA方法对分泌抗口蹄疫146S抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞进行检测。采用有限稀释法对筛选出来的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，并进行扩大培养及大量冻存，使用腹水法大量生产单抗。使用间接ELISA法测定腹水型单克隆抗体及细胞培养上清液的效价，对各株单抗的腹水样品进行免疫琼脂扩散试验来确定单抗的类型。通过West-blotting试验确定抗体构型。确定抗原含量与抗体滴度之间的线性关系。

简单来说该方法就是制备口蹄疫病毒单克隆抗体，建立血清学方法测定疫苗中总抗原含量。该方法优点是成本低，利于推广使用，可以批量进行样品抗原含量的比较，操作简单快速，结果特异，缺点是单克隆抗体制备过程复杂，且只能检测部分抗原位点，若抗原位点组成有变化，使用该检测方法可能有误差。

2.蔗糖密度梯度法

在口蹄疫疫苗的生产过程中，146S病毒粒子作为口蹄疫病毒的主要免疫原，其任何形式的降解都会导致疫苗免疫效力的下降。传统的监测方法中首先通过补体结合试验估测总抗原含量(包括146S和12S)，然后用氟化碳处理除去12S抗原，间接估测出主要免疫原146S的CF量；或者超速离心获得146S抗原，直接估测146S的CF量。一些生产厂家通过蔗糖密度梯度离心法获得一定体积口蹄疫病毒146S病毒粒子,使用紫外分光光度计在259nm紫外光下检测吸收峰，从而测定其含量。采用这种方法可以快速测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的146S病毒粒子含量，并且可以用于生产过程中病毒和抗原收获量的监测，也可用于成品苗中口蹄疫病毒146S抗原含量的测定。测定口蹄疫病毒146S抗原量也可通过氯化铯密度梯度离心法进行定量分析,在ug/ml水平估测146S抗原量,并用PAGE凝胶电泳检测口蹄疫病毒抗原多肽的完整性，并确定其质量。

3.组织细胞培养法

组织细胞培养法主要使用实验重复性较好的BHK21传代细胞系来进行，通过在显微镜下观察不同稀释度的 FMD病毒感染 BHK21细胞时所产生的 CPE来判定实验结果，该实验耗时较长，人为因素影响较大。

4.病毒蚀斑数测定法

目前，国外一些实验室和疫苗公司采用病毒蚀斑数测定法。使用BHK21细胞或IB-RS-2细胞，按常规方法来培养细胞，用无菌 PBS冲洗细胞，病毒作梯度稀释，接种细胞培养板，在CO2培养箱里培养 1小时后，加入一定量的培养液，静置培养48小时，弃去培养液，加固定液固定，染色30分钟，蒸馏水冲洗，自然干燥后进行判定。FMD病毒感染细胞时，先感染离它最近的细胞，最终形成了一个个肉眼可见的病毒感染斑，对感染斑记数，按特定的公式来计算病毒的滴度。该法操作方便，判定方法简单快捷，测定结果也很准确，值得借鉴。缺点是没有涉及到抗原性的变化。

5.乳鼠接毒法

病毒梯度稀释后接种乳鼠，一定日期内统计小鼠死亡数量，计算病毒的LD50。该方法缺点是用时较长，通常为3～4天，不利于疫苗生产企业的集约高效生产。另外，动物水平的实验由于样本数量的限制，误差较大。

6.荧光定量PCR

实时荧光定量RT-PCR(Realtime Fluorescent Quantitative PCR)技术是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。该技术以特异性强、速度快、灵敏度高等优点，在基因表达水平分析、病原体基因的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸快速检测的主要方法。利用口蹄疫146S抗原定量技术抗原含量关系的标准抗原作为对照，通过对口蹄疫病毒的RNA进行检测，并进行待检样品与标准抗原曲线的对比，实现由病毒RNA荧光Ct值的测定向抗原含量的转变（Ct值指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系）。该方法操作用时短，节约生产成本。缺点是检测过程可能出现反应的不稳定性，造成误差。

7.蛋白层析法

胶体金免疫层析技术（GICA）是20世纪80年代在胶体金标记技术、免疫层析技术基础上建立的一种独特的免疫学检测技术。它以胶体金作为示踪物，利用特异性抗原抗体结合原理，通过胶体金颗粒的颜色放大免疫反应系统，使反应结果在固相载体上直接显示出来。

FMDV感染动物后可造成隐性感染，并在易感动物之间进行传播。制定区分感染动物与免疫动物的有效检疫是控制其流行的根本措施。FMDV的一种 NSP抗原(VIAA，3D)仅与感染动物的血清产生反应，随着对FMDV NSP研究的进一步深入，研究者认为针对非结构蛋白3ABC抗体的检测是一种理想的检测方法。在这些研究的基础上，可利用大肠杆菌高效表达的FMDV 3ABC多肽作为包被抗原，建立可区分感染动物与免疫动物的试纸条技术。

胶体金试纸条具有操作简单，检测速度快等优点，但是该方法的 结果判定是通过观察检测显色条带的有无，因此大多数胶体金免疫 层析试纸条只能用于定性和半定量的检测。

8.分子排组色谱法

2011年Marcelo等建立了一种新的方法来定量口蹄疫病毒完整粒子。是在疫苗生产过程中通过分子排阻色谱来分离病毒培养液中的不同组分，将146S分离出来，通过波长254nm下的光吸收值来测定146S含量。检测范围为 5～70ug／mL，该方法适用于不同的口蹄疫病毒株，与蔗糖密度梯度离心法有良好的相关性。这种方法使用标准的层析介质，可以实现自动化操作。这种方法如果能开发成一种成熟的检测试剂盒，极有可能成为口蹄疫疫苗生产过程中的一种新检测工艺，用于监控最终产品的质量。但与其他方法相比，该方法最低检测限高，灵敏度低，不适宜用于146S含量较少的样品，不能区分检测到的146S是否被蛋白酶水解。该方法自动化程度高，操作相对简单，但检测灵敏度目前不高，有待进一步的提高。

9.其他

用于抗原定量的其它方法有放射免疫试验、反向被动血凝试验及固相红细胞凝集试验。这些试验的敏感性也较高,特别是反向被动血凝试验和夹心ELSIA 具有同样的敏感性。用这些方法所进行抗原定量和疫苗的免疫保护的关系尚需进一步研究。

总之,用以上讨论的方法检测疫苗都有报道。但到现在为止国际上还没有一种统用的、标准的方法来检测疫苗的抗原含量。这就一方面需要实验室间的合作,另一方面对这些方法需要进一步研究。总体而言，目前我国口蹄疫灭活疫苗的质量监控系统比较完善，相对于各种疫苗的质量检测技术和手段正在不断的提高，向着更加标准化、精确化和便捷化的方向发展。兽药监察及检验机构对口蹄疫疫苗抗原含量的检测技术的研究也在不断的完善和创新，以确保安全有效的疫苗用于口蹄疫疫病的防控，为我国畜牧业的健康发展提供坚实的保障。